人类疾病蛋白质组学的重要进展丨中国科学家
自21世纪以来，生命科学各类计划一直由欧美国家领导，由美国牵头的人类肿瘤基因组计划（TCGA），在过去十几年里描绘了数十种肿瘤的基因组变异图谱，绘制了癌症的基因组“地形图”，为人类对癌症的理解做出了巨大的贡献，也催生了美国的“精准医疗计划”和“肿瘤登月计划”。蛋白质作为生命活动的执行者，和基因相比应该与疾病有更直接的关联，而作为后基因组时代的蛋白质组学在中国的发展一直保持着与国际齐头并进的态势。年启动的“中国人类蛋白质组计划”（CNHPP）通过绘制人类十大恶性肿瘤的蛋白组“地形图”，试图在蛋白这个更高级的维度上理解肿瘤，揭示肿瘤的分子机制，寻找治疗靶标。
日前，NatureCommunications在线发表了一项由国家蛋白科学中心（凤凰中心）医院共同开展的弥漫型胃癌蛋白质组研究最新成果，论文共同通讯作者分别为国家蛋白科学中心秦钧教授，医院沈琳教授和军事科学院贺福初院士。文章首次描绘了弥漫性胃癌的蛋白质组全谱，绘制了胃癌的蛋白组“地形图”，为深刻理解胃癌分子机制提供了宝贵素材并为胃癌病人的精准医疗提供依据。为了让更多专业同行深入了解该工作，BioArt特别邀请到长期从事蛋白组学相关研究的西湖高等研究院郭天南研究员进行深度专业点评，以飨读者！
胃癌在全球肿瘤死亡原因中排名第三。我国是胃癌发病和死亡的重灾区，年新发胃癌40.5万，占全世界的40%以上。目前国际上广泛应用的Lauren分型从形态学上将胃癌分为肠型、弥漫型和混合型，其中弥漫型预后最差，且缺少有效的靶向治疗手段。尽管国际上发表过基于基因组和转录组的胃癌分子分型，但均没有与临床预后实现有效的关联性。和基因测序相比，蛋白组测量在技术上极具挑战。由于蛋白具有不能直接扩增的特性，蛋白组测量的灵敏度、通量和稳定性一直是困扰蛋白组领域的难题。
据BioArt了解，从年开始，在北京市科委前沿项目的资助与医院陈凛主任的大力协助下，秦钧团队历时两年基本打通胃癌蛋白组学分析技术路线。从年开始，该医院沈琳主任团队开始大规模胃癌样品分析。该项研究收集了年12月至年7医院进行手术的例胃癌样品，筛选得到84对满足研究要求的癌和配对的癌旁组织样本。自此，团队开启了绘制首个弥漫型胃癌蛋白质组学图谱和肿瘤驱动基因变异图谱的征程。到年6月，团队基本完成84对样品的质谱测量工作，共鉴定到个不同的基因产物，这些蛋白质覆盖了肿瘤细胞及肿瘤微环境所有可能表达的蛋白。在数据分析过程中，适逢团队历时5年建立的国际首个蛋白质组一站式分析云平台Firmiana（详见BioArt此前的报道：NatBiotech：中国学者建立国际首个一站式蛋白质组数据分析云系统Firmiana）开始运行，这催生了胃癌表达谱分子分型工作流，候选药物靶标分析工作流，和基因变异与蛋白关联分析工作流的建立。
经过一年多的数据分析和知识挖掘探索，秦钧团队欣喜地发现仅对84对胃癌与癌旁组织全蛋白表达谱进行聚类分析，就可以将弥漫型胃癌分为三个分子亚型（PX1~3），而且这三个亚型与生存预后和化疗敏感性密切相关。这是世界上第一次实现在蛋白层面上对肿瘤进行分子分型，且分的的亚型与预后和化疗有显著性关联！其中PX1型（细胞周期型），总生存时间最长；PX2型(上皮-间充质转化型)，生存预后介于PX1和PX3之间；PX3（免疫通路富集型）患者肿瘤组织高表达蛋白富集在免疫响应相关通路和EMT相关蛋白上，总生存时间最短，并且该组患者对化疗不敏感。特别令人激动是，这种蛋白分型不依赖于任何基因组信息，体现出作为功能直接执行者的蛋白质在临床科学中所提供信息的重要性和全面性。文章进一步的研究筛选出23个与预后相关的胃癌候选蛋白药物靶标，并提示弥漫型胃癌在以下四个通路最有可能找到治疗靶标：经典的肿瘤生长通路、代谢和氧化应激过程、细胞黏附和侵袭过程以及肿瘤和肿瘤微环境中的免疫调控。
研究团队还针对目前热度较高的肿瘤免疫治疗的“地形图”进行了详尽的分析。发现最近研究火热的PD-L1/PD1在弥漫性胃癌中鲜有表达，不太可能适合用作弥漫型胃癌的治疗靶标，而包括IDO1、ARG1和CD47/SIRPA等在内的多种免疫相关蛋白在弥漫型胃癌中表达较高，尤其在PX3肿瘤组织中显著高表达，且表达量与生存时间显著负相关，有可能作为免疫治疗的候选靶标。上述靶点是否有效，尚需大规模临床实验进一步证实。这些研究提示，肿瘤的临床试验要利用相应的标志物，筛选病人入组以提高临床试验的成功率。
团队同时也定向检测了个肿瘤Driver基因的突变，发现个基因能检出突变。令人吃惊的是，研究发现有13%（25/）基因可以检测到突变，但在癌与癌旁中均未检测到其蛋白表达。更惊奇的是，在几例病人的样品中，研究人员可以检测到著名的KRAS和NRAS”激活“突变，在癌旁也可以检测到蛋白，但在癌中却检测不到KRAS或NRAS蛋白。这预示着基于RAS基因测序作指导的精准医疗，在这些病人中或许会出问题，因为治疗的蛋白靶点在肿瘤中是不存在的。
单独依靠基因组数据而不依靠蛋白质组数据来进行基因的功能预测，甚至作为靶向治疗的依据，其可靠性是值得怀疑的。这提示我们人类健康医疗呼唤蛋白组学驱动的精准医学。
胃癌蛋白质组“地形图”的完成，标志着以贺福初院士为首席科学家的“中国人类蛋白质组计划”（CNHPP）攻下了第一座精准医学城池，是中国十余年蛋白质组研究成果的具体展示。这个课题的科学意义在于向人们展示，测量蛋白就可以实现肿瘤的分子分型，发现肿瘤治疗的靶标，激发人们开展蛋白组学临床转化的潜能，是实现蛋白组学驱动的精准医学的曙光。
题外话：从科技创新角度讲，该研究是我国蛋白组学从“跟跑”、“并跑”逐渐转变为“领跑”的体现。从整个项目的实施过程来看，平台、方法都是从无到有，最终建立了一站式中国蛋白组学和生物信息学的分析平台，实现了从0到1的突破。更重要的是，该项目的实施，培养了中国蛋白组学的队伍，奠定了CNHPP的技术流程和科研思路。
花絮：秦钧团队为什么选择胃癌作为研究方向呢？这里面有个小插曲。据秦钧教授透露，年底，北京蛋白质组研究中心的一位同事被诊断为胃癌，秦钧团队遂决定将蛋白质组研发平台用于开展胃癌蛋白组学研究，为更加详尽理解胃癌提供蛋白组学数据，为病人服务。
同行点评：
评凤凰中心和医院的关于弥漫性胃癌的蛋白质组分型的合作研究
郭天南（西湖高等研究院研究员）
要深入理解近期凤凰中心和医院合作发表的这篇文章，笔者认为读者有必要对相对比较新的蛋白质组领域有一定的了解，故试简述如下。
在很大程度上，精准医学时代的预热和到来，主要是由人类基因组计划的完成和应用推动的。除了在一些遗传性疾病的杰出应用，人类基因组计划有力的推动了基因组和转录组测序技术的快速发展。近20年来，测序的价格实现了指数性的降低。以华大基因为代表，我国科学家使用基因组测序和转录组测序技术在多个领域取得了令世界瞩目的科学成就和应用成果。近来，我国在单细胞的基因组和转录组测序领域也相对处于世界领先地位（见Bioart近期有关报道）。
蛋白质是生命活动最重要的物质，是DNA和RNA参与绝大部分生命活动的具体执行者。绝大多数蛋白质都具有复杂的三维结构，甚至四级结构（多个蛋白质形成的复合物），这些独特的结构信息对理解蛋白质的基本功能和药物设计具有重要指示作用。近10年来，我国在蛋白质结构分析领域取得了一系列重要进展，就研究成果而论不亚于欧美等科技发达国家。
在生命活动中，蛋白质的另一个关键因素是其表达水平，例如蝌蚪和青蛙的区别主要是由于蛋白质表达水平的变化。蛋白质组学研究是一门系统测量蛋白质表达水平的学科。中国在较早期就参与了这一学科的建设，在人类蛋白质组学组织的成立和壮大中发挥了重要作用。近几年，美国阶段性结束了癌症基因组图谱计划（TCGA），开启了临床肿瘤蛋白质组计划（CPTAC），展开多项国内国际合作，对经过基因组测序的肿瘤再进行蛋白质组学研究。在我国，以凤凰中心为代表的科研人员也启动了中国人类蛋白质组计划（CNHPP），期望绘制10种恶性肿瘤的蛋白质组图谱，从蛋白维度理解肿瘤的分子机制，寻找治疗靶点。
值得一提的是，虽然蛋白质组学在近20年来持续快速发展，但是仍未达到如基因组和转录组学一般的成熟水平。笔者认为蛋白质组学研究尚未获得其应有的度。在这一背景下，凤凰中心持续多年努力，推动我国的蛋白质组学研究，在近期涌现出了一系列令人瞩目的成果。去年，凤凰中心、华东师范大学和复旦大学合作发表了基于云存储和云计算的一站式蛋白质组数据分析平台Firmiana（中文意指引凤之巢梧桐树）。这次，凤凰中心和医院合作发表了使用凤凰设施对84位弥漫性胃癌患者的组织进行的蛋白质组学研究，提出了基于蛋白质表达水平的PX分型。
在这篇文章中，作者层层筛选出84位弥漫性胃癌患者，提取他们的肿瘤和癌旁组织，使用fast-seq的无标记鸟枪蛋白质组的技术，对个组织样本逐个进行了6个组分的预分离，再使用ThermoFisher的QExactivePlus和QExactiveHF质谱仪进行75分钟高效液相色谱梯度的检测，共计产生个原始文件。数据先使用ProteomeDiscoverer1.4和NCBIRefseq蛋白质数据库对数据进行分析，然后使用iBAQ作无标记定量。在不高于1%的多肽和蛋白的假发现率的水平上，作者鉴定到个基因产物蛋白质（GeneProducts，简称GPs），包括肿瘤细胞及肿瘤微环境表达的蛋白。这是目前在肿瘤蛋白质组领域，继结直肠癌、乳腺癌和卵巢癌之后的又一个重大进展，也是目前针对弥漫型胃癌研究覆盖率最高的蛋白质组学数据集。
为进一步提高数据质量，作者对数据进行了更加严格的筛选，发现个GPs含有至少2个独立多肽。考虑到非标记定量的缺失值和准确性，作者最终选择了个GPs进行主成分分析，并从中挑选了个GPs对弥漫性胃癌进行组织的临床分型。此外，作者还对样本进行了靶向外显子测序，测量了个癌症相关基因的突变状态。从蛋白质组的数据数量和质量上看，这项研究是近年来国际癌症蛋白质组领域发表的最好的成果之一。这项研究对在亚洲（包括中国）发病率相对较高的胃癌的蛋白质组进行了最详尽的分析，是近年来国际癌症蛋白质组领域发表的最好成果之一。笔者个人认为，这项研究是我国临床蛋白质组学至今为止取得的最好成果。
仅仅基于蛋白质组数据，作者将弥漫型胃癌分为三个分子亚型（PX1~3）：PX1型，富含细胞周期调控蛋白的异常表达，基因突变数目最少，总生存时间最长；PX2型，表现出上皮-间充质转化的蛋白质调控异常，生存预后介于PX1和PX3之间；PX3，肿瘤高表达免疫响应相关通路蛋白和EMT相关蛋白，总生存时间最短，并且该组患者对化疗不敏感（下图）。这个分型如果能够在独立队列中得到验证，有望对临床诊疗产生实际影响。
这项成果的主要领导者之一秦钧教授曾在美国贝勒医学院工作多年，在千人计划的资助下回国开展研究工作。在基因组和转录组学大步高歌、而蛋白质组学尚不成熟的特殊时期，秦教授回国后看准蛋白质组学在临床医学的应用潜力，跳出舒适区，全力以赴的攻关一个对他个人、对世界而言都是充满挑战的领域--临床蛋白质组学。他与军事医学科学院的贺福初院士和其他同仁们一起建立了国家蛋白质中心（北京），从零开始建立了一整套从样本制备、质谱分析到数据分析的质谱设施，培养了大批专业人才和学生，并且参与举办多次蛋白质组学培训课程和国际国内学术会议，为中国蛋白质组学的发展做出了重大贡献。
这篇文章所报道的成果是由凤凰中心医院的临床科学家们合作研究所获得的。临床研究相较一般生物学研究而言难度更高，需要的积累更多，遇到的实际困难也更多。在目前国内相对比较浮躁的学术环境下，秦教授和同仁们保持初心，不计一时得失，严谨的筛选样本，从多个样本中一步一步筛选到84个样本，并仔细整理临床资料，从1万多个基因产物蛋白质中一步一步筛选到多个能够对胃癌分型的关键蛋白。笔者认为，这种严谨的科学研究态度尤其值得我们学习。
这项成果是贺福初院士和秦钧教授推动的“中国人类蛋白质组计划”（CNHPP）中的一个里程碑，但是笔者相信这一成果绝不会是最后一项成果，也不一定是最重要的一项成果，而是一个崭新的开端。将蛋白质组学真正应用于胃癌诊治的临床实践，还有不少科学和技术的障碍；除了胃癌，还有多种肿瘤正困扰着国人和全世界人民；除了癌症，还有众多疾病也需要新一代的基于蛋白质诊断的精准医疗方案去解决。
我们期待凤凰中心能获得更多的成果，带动中国蛋白质组学的全面发展，从而让中国在蛋白质领域能够真正引领世界，让中国在基于蛋白质的临床诊疗占据战略高地。（完）
致谢：感谢西湖高等研究院的沈小莲和李凯娜对本文的修改。
参考文献：
1. TheCancerGenomeAtalasNIH北京中科白殿疯病医院南京白癜风专科医院
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