CTC拷贝数畸变检测成功预测化疗耐药性

小细胞肺癌（small-celllungcancer,SCLC）是一种高侵袭和转移的疾病。大多数SCLC患者初始治疗时表现为化疗敏感，复发治疗时获得化疗抵抗性。而一小部分患者在初始治疗三个月内便会复发，表现为化疗耐药性。区分化疗敏感和化疗耐药的分子机制目前尚未明确。为了探讨区分化疗敏感和化疗耐药的遗传特征，我们检测了小细胞肺癌患者循环肿瘤细胞（circulatingtumorcell,CTC）的拷贝数畸变（copy-numberaberration,CNA）情况。首先我们对来源于13例患者（定义为训练组）的88个CTC样本进行检测，根据CNA情况建立了分类器。接下来我们通过对来源于18例患者的个CTC样本和来源于6例患者CTC来源的移植肿瘤（定义为测试组）进行检测，验证我们的分类器。结果显示：此分类器可将83.3%的患者准确区分为化疗敏感组或化疗耐药组。且两组间的无进展存活时间（progression-freesurvival,PFS）有显著差异。（Kaplan-MeierP值=0.）。值得注意的是，通过对5例化疗敏感患者复发时CTC拷贝数畸变谱分析发现，其复发时CNA图谱并不会转变成化疗耐药的CNA图谱。这提示我们，先天化疗耐药的遗传学基础有别于获得性化疗耐药。

由于SCLC手术切除的罕见性，以及组织活检样本较小且质量差，相较其他癌症，我们对SCLC的基因组学研究相对较少。然而，近期三项里程碑式的研究结果显示：SCLC基因改变和突变频率较高，仅次于黑色素瘤，居第二位。SCLC以RB转录共抑制因子1（RB1）和p53（TP53）蛋白的突变失活为特征。对例SCLC肿瘤样本测序分析发现：SCLC中有91%的RB1和98%的TP53的双等位基因缺失。另外，在SCLC中，SOX2，BCL2，MYCL1，MYCN和MYC等凋亡和转录调控因子的扩增及NOTCH家族基因的突变失活普遍存在，并伴随其他低频率的基因改变现象。除了最近的研究，其他关于特定遗传学畸变特征与SCLC临床结果相关性的研究资料相对匮乏。而且，在此类研究中，几乎无研究数据将CTC用以代替肿瘤组织检测。

前期我们和其他研究组的数据显示：SCLCCTC普遍存在，且CTC数目可作为预测存活时间的预后因子。把SCLCCTC注射到免疫缺陷的小鼠体内会形成肿瘤，即患者CTC肿瘤移植模型（CDX）。所以，原发肿瘤组织无法获取时，CTC可作为重复采集的液体活检材料用以探究SCLC生物学和化疗反应的机制。在本文中，我们探讨了以CTC为基础的分子标志物是否可作为预测患者化疗敏感或化疗耐药的指标。

SCLC患者在一线治疗期间或治疗后90天内疾病进展被定义为化疗耐药者，在治疗后＞90天疾病进展则被定义为化疗敏感者（图1s）。我们首先检测了13例SCLC患者的CTC样本。这13例患者中有6例为化疗耐药者，其余7例为化疗敏感者。通过CellSearch技术富集CTC，7.5ml血液中CTC检出个数分布在27到之间（中位数）。进一步，通过意大利SiliconBiosystems公司的DEPArray系统分选出单个CTC，poolCTC和白细胞（whitebloodcells,WBC）。最终，我们评估了13例SCLC患者中72个CTC细胞（每例患者2-10个），16个poolCTC（10CTC/pool），8个WBC和12个poolWBC（10WBC/pool）的信息。首先对这些分离出来的细胞样本进行全基因组扩增（whole-genomeamplification,WGA）,通过质控PCR选择基因组完整性指数（genome-integrityindex,GII）≥2的样本用于后续实验。（图1a）。对所有样本构建测序文库，并进行低分辨率全基因组测序（whole-genomesequencing,WGS）。最终以每位患者的WBCDNA为参照用生物信息学方法对其WGS数据进行CNA分析。

图1s

首先，对分离出来的CTCWGA样品分析13个已知在SCLC中经常扩增或缺失的基因。研究发现：所有患者这些基因均有缺失或扩增，与之前SCLC肿瘤的研究结果一致（图1b）。进一步，对所有SCLC中有明显改变的基因进行分析，发现：CTC中的基因扩增或缺失水平与SCLC肿瘤中的情况一致，而这种变化在相应的WBC对照样本中并未检测到。这提示我们，CTC遗传图谱可作为肿瘤组织替代物用于临床。接着，以此13个基因的测序结果用非先导分层聚类分析法分析CTC，探讨其是否与患者的化疗敏感性或化疗耐药性相关。然而，虽然这13个基因的表征具有异质性，但是却不能依据患者的化疗敏感或化疗耐药状态将其区分开（图1，b）。

图1对13例SCLC患者CTC进行起始的分子分析

（a）DEPArray图像示例从SCLC患者血液中分离出来的单个CTC（CK+：绿色，CD45+：蓝色，DAPI+：紫色）。分离和WGA后，质控PCR检测每例样品的基因组完整性（0-4个条带）。单个CTC，poolCTC，单个WBC和poolWBC采用同样的操作流程。DNAmarker大小标注于图片左侧，DEPArray图中比例尺代表7um。（b）热图显示SCLC中常见扩增或缺失的13个基因的拷贝数图谱。主图所示为来自13例患者的88个CTC中每个基因的扩增（红色）或缺失（蓝色）情况，右侧为Rudin和Peifer研究组的对应CNA变化情况。对CTC中这13个基因的畸变情况用分层聚类分析法归类并不能区分患者是化疗敏感者（绿色）还是化疗耐药者（紫色）。

进一步，对单个CTC的全基因组CNA概况进行分析，发现患者3q,5p区域扩增，3p,17q区域缺失，与之前报道一致（图2a）。基于全基因组染色体畸变的非先导主成分分析（principal-







































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