使用单细胞测序技术揭示三阴性乳腺癌在患者

汇报人：LuYinLab研究生一年级王圆使用单细胞测序技术揭示三阴性乳腺癌在患者化疗过程中耐药性进化模式及机制在这次的推送中，和各位读者分享一篇于年3月发表在cell（IF=36.）上的文章《ChemoresistanceEvolutioninTriple-NegativeBreastCancerDelineatedbySingle-CellSequencing》。本文的通讯作者是美国德州大学MD安德森癌症中心遗传学系和生物信息学系尼古拉斯·纳文副教授，他同时兼任MD安德森癌症中心测序中心主任。纳文教授课题组主要研究方向为肿瘤进化以及肿瘤异质性，使用单细胞测序技术结合计算生物学和生物信息学对数据进行分析与处理。

研究背景

“肿瘤进化”的概念最早出现在年PeterNowell发表在Science期刊上的论文《Theclonalevolutionoftumorcellpopulations》中，他开创性地提出了肿瘤细胞群克隆进化学说，认为连续多轮的克隆选择是导致癌基因及其他分子变异的根本原因。在这之后的研究中，肿瘤内部细胞异质性的发现以及肿瘤靶向药耐药性的产生也进一步的证明了肿瘤进化的存在。以cancerevolution为关键词进行检索，可以发现近十年来关于此类的文章逐年增加，且高分文章居多。目前关于肿瘤进化的模式存在很多争论，在此主要列出了四种主要的模式[1]。线性进化、分支进化、中性进化和间断进化模式。线性进化模式类似于被取代的结果，具有生存优势的肿瘤细胞群将其他肿瘤群清扫以及替代；分支进化过程中多个克隆同时形成并扩增，它们都具有更好的适应性，随着时间的延伸，不同子代肿瘤细胞间表现出一定差别。中性进化模式进行的是中性突变，即对生物既无利也无害，在进化过程中，突变压和随即固定起着重要作用，只有进一步导致形态和生理上的差异后，自然选择才能发挥作用；以上三种进化模式都是渐进的，匀速的，而间断进化则是非匀速的，认为大量的基因组突变可能在肿瘤早期短时间内形成，形成之后保持长时间的稳定。测序分析是目前研究肿瘤进化的重要手段之一。测序技术测序技术从第一代Sanger测序，发展到第二代测序，到目前最新发展到第三代单分子测序。。其中使用最多的为第二代高通量测序，测序平台为IlluminaHiSeq，这也是本文使用的测序平台。与第一代Sanger测序相比，第二代测序技术成本低，通量高，测序速度快。例如，人类基因组计划当初使用一代Sanger测序完成，耗时近十年，而若使用如今的二代高通量测序，测序工作一周内就可以完成。本文使用的单细胞测序技术，是以二代测序为基础的测序技术，该技术为《NatureMethods》年度技术，《Science》十大科学突破榜首。单细胞测序技术与肿瘤研究密切相关。因为肿瘤的一个重要特征就是异质性。肿块中心与肿块周围的细胞，原发灶与转移灶的肿瘤细胞，其基因组和转录组等遗传信息是存在差异的，而这种差异，会导致治疗效果的差异。传统的测序方法是在多细胞水平上进行的，是测一群细胞(BulkRNAseq)，然后分析所有细胞内的基因平均表达量，这样得到的是组织与组织之间的差异性，也就是说只能看到大体的趋势，，使其丢失了异质性的信息，而单细胞测序可以解决这个问题。单细胞测序最终得到的是每个细胞的表达量，从而可以帮助理解组织内部异质性，揭示细胞之间的表达差异，使结果更加精准。新辅助化疗（NAC）又称术前化疗，目前已经成为许多三阴性乳腺癌患者的术前标准护理，治疗目的是先做化疗使肿瘤缩小，缓解病情，再通过手术或放疗等方法治愈肿瘤。NAC对于一些乳腺癌患者有效，然而，约有一半患者在治疗过程中会出现耐药性，其基因型和表型都会发生改变，导致总体存活不佳。针对这种耐药性的产生模式学术界存在两种学说：一种学说即固有性耐药基因学说，该学说认为耐药基因与抗性表型治疗之前就存在于肿瘤中，通过治疗被适应性选择使占比增加；另一种学说又称为获得性耐药基因学说，该学说认为耐药基因与抗性表型完全是因为治疗而产生的后期突变。所以本文作者需要解决的问题就是，耐药基因与抗性表型是治疗前就存在还是治疗后突变产生？作者将目前存在的两种学说结合，提出了假说：耐药基因突变在耐药性产生之前就已经存在于肿瘤中，并在化疗过程中被适应性选择从而产生耐药性表型。

研究结果

Result1使用新辅助化疗对三阴性乳腺癌患者进行治疗

作者选取了20名三阴性乳腺癌患者，对其进行新辅助化疗，化疗药物是DNA嵌入剂-表柔多星，有丝分裂抑制剂-多西他赛，血管生成抑制剂-贝伐单抗，并在化疗之前，化疗2个疗程时和化疗6个疗程时对患者肿瘤取样，样本处理后进行测序分析。

Result2根据NAC的治疗效果将患者分为敏感型和耐药型两种类型

作者首先对组织样本进行了外显子测序，结果显示10名患者治疗之后原始突变消失，为敏感型患者；10名患者治疗之后突变仍存在，为耐药型患者（图A-B）。接着作者对这两类患者的等位基因突变频率(MAF)做了线图展示。结果发现，敏感型患者化疗后突变消失，而对NAC产生抗性的患者治疗后产生了部分新突变。例如17号患者产生了13个新的非同义突变，包括编码凋亡抑制蛋白BIRC7、肌动蛋白结合蛋白PARVG的非同义突变；19号患者也出现了与转运活性有关的基因突变（图C-D）。对于NAC治疗后出现的新突变，作者就思考是否在治疗前的肿瘤细胞中真的不存在？还是因为外显子测序深度（×）不够而导致没有检测到？所以作者随后选择了一组治疗后产生的新突变基因，对其中五名耐药型患者治疗前的肿瘤样本进行了扩增子测序（1,,×），血液作为体细胞突变对照。扩增子测序是一种高靶向性、高深度的测序方法，用于分析特定基因组区域中的基因变异。结果发现4名患者NAC治疗前的样本中能够检测到这些新的突变，说明含有这些突变的克隆一开始就存在于肿瘤组织中，只是频率极低（图E）。19号患者因为取样等原因导致结果无效（图F）

Result3敏感型患者的拷贝数进化过程

接下来作者进一步探索了拷贝数在治疗中的进化过程。拷贝数变异（CNV）是由基因组发生重排而导致的，一般指长度为1kb以上的基因组大片段的拷贝数增加或者减少，是人类疾病的重要致病因素之一。本文使用了DNA单核测序方法，该方法是对单细胞测序技术的改进。因为传统单细胞测序技术，需要使用新鲜组织，但是在癌症研究中大多数组织样本都是冷冻组织，冷冻过程会破坏细胞膜，单核测序则可以避免这个问题。作者分析了4位敏感型和4位耐药型患者中的个单细胞。首先将肿瘤组织分离成核悬浮液，DAPI染色后通过DNA倍性进行流式分选。将筛选出来的肿瘤细胞核核分配到96孔板中，并通过DOP-PCR进行全基因组扩增（WGA）。扩增完成后，对每一个样品接头加上不同的标签，随后进行测序，在测序结果中，依据之前标签与样品的对应关系，就可以获得对应样品的数据，从而进行拷贝数分析。在仅考虑CNA的情况下，作者对测序结果进行聚类分析，t-SNE降维可视化后，发现四名敏感型患者治疗前和治疗后的细胞清晰地分为两块，并且治疗前细胞为癌细胞特征（非整倍体），而治疗后细胞为正常细胞特征。T-SNE确定了治疗前的三名患者（P2，P6，P9）中两个主要克隆，另一名患者（P1）中有三个主要克隆（图A）。接着作者绘制了全基因组范围拷贝数变化热图，关键癌基因拷贝数变化以及使用TimeScape进行克隆进化动态分析（图B-E）。热图显示治疗前的细胞中有大量的拷贝数变异，呈现肿瘤细胞的非整倍性，而治疗后的细胞为正常倍性。克隆进化动态图表明肿瘤的亚克隆都是从早期的单克隆中发展形成，在早期存在共同的突变，虽然在中后期发生偏离产生一些具有特有变异的亚克隆，但化疗后这些肿瘤亚克隆都会消失。

Result4耐药型患者的适应性拷贝数进化

同样的，作者又对4名耐药型患者进行了拷贝数进化分析。在仅考虑CNA变化的情况下，聚类分析的结果发现在四名患者中，少数治疗前的肿瘤细胞与治疗后的肿瘤细胞聚集在一起，表明治疗前的细胞就具有了耐药基因（图A）。此外，这四名患者的热图表明治疗前与治疗后的细胞均有大量的拷贝数变异，呈现肿瘤细胞的特性。通过TimeScape进行克隆动态变化分析（图B-E），发现大多数亚克隆之间早期存在共有的基因拷贝数增加或缺失，但是部分CNA仅于某些克隆中存在，如P14患者中，抗性相关克隆A中IL5RA、RARB基因的缺失，含有这两个突变的克隆A占比从治疗前的7.7%增加到了71.8%（图B）。这说明了NAC抗性患者在治疗前肿瘤组织中就存在了变异，但是随着NAC治疗的诱导，部分克隆通过更好的适应性占比不断增加，促进肿瘤抗性产生。

Result5敏感型患者肿瘤细胞的转录重编程

以上是基因型进化研究结果，作者接下来进行了表型进化的研究，分析单个细胞的转录组表达。使用单核RNA测序技术分析了4名敏感型患者和4名耐药型患者接受NAC治疗后的表型进化。首先，作者对4名NAC治疗受益者进行了分析。利用了该实验室年一篇文章里面的个染色体倍性正常的乳腺细胞的拷贝数数据作为正常对照[2]。聚类热图表明，治疗前的细胞聚为一簇，且呈现癌细胞的非整倍性。治疗后的细胞与正常细胞聚为一簇，表现为正常倍性（图A-B）。功能分析也是转录组测序分析流程中的重要的一部分。通过对差异表达基因的功能和可能参与的代谢通路进行分析，从而找出导致表型差异的分子生物学原因。作者使用MAST在治疗前的肿瘤细胞和治疗后样品的上皮细胞之间检测了表达有差异性的基因。确定了12种已知的癌症基因，这些基因在这4名克隆消失患者中，治疗前表达均显著上调（图C）。为了确定TNBC患者是否共有某些癌症表型，使用基因集变异分析（GSVA）找出了该患者群体的肿瘤细胞中可能对NAC治疗敏感的相关通路，这些分子通路在治疗前的癌细胞中高度富集，但是通过NAC治疗后富集度显著降低，表明包括肌动蛋白，细胞增殖等基因和信号通路可能在赋予TNBC患者对NAC化学疗法敏感性方面起作用。此外呢，作者结合了四名患者的所有肿瘤细胞和正常细胞的RNA数据，高维分析后t-SNE降维可视化后表明，正常细胞和肿瘤细胞形成两个不同的簇（图E）。在治疗后样品的正常细胞群中，作者发现了高水平的ACTA2成纤维细胞标记，在治疗前的肿瘤细胞群中，发现了高水平的EPCAM上皮标记物（图F）。所以作者接下来使用了细胞类型特异性标记，进一步将治疗后样本中的所有正常细胞按八种主要的乳腺细胞类型进行分类，结果显示成纤维细胞是NAC之后存在最丰富的细胞类型（图G）。

Result6耐药型患者肿瘤细胞的获得性转录重编程

同样的，作者也对4名耐药型患者的转录数据进行了分析。热图结果与敏感型患者相反，在治疗前和治疗后样品中均检出了大量的非整倍体细胞，治疗后的细胞仍呈现癌细胞特性，而且是跟治疗前区别很大的癌细胞。说明转录重编程是在治疗之后产生的（图A-B）。差异表达基因Venn图表明，每个患者有59-个差异表达的基因（图C），包括一些重要的基因包括已知的癌症基因（MYC，ERBB3，KIT和PIK3R1等）。为了鉴定耐药性肿瘤细胞的常见表型，作者使用基因集变异分析（GSVA）对一组与癌症相关的特征进行了单细胞基因特征分析。该分析确定，在化学抗性肿瘤中，包括细胞外基质降解（EMC），AKT1信号转导，CDH1靶标，缺氧，EMT和血管生成的相关基因标志在NAC治疗后上调（图D），所以作者在高维空间中进一步标记了耐药基因信号，t-SNE降维后显示它们在NAC治疗后样品中高度富集（图6E）。此外呢，作者还针对这六个特征做了生存分析，结果表明AKT1信号传导和缺氧这两个特征的高表达，在统计学上与较差生存率显著相关（图F）。

总结与讨论

本文通过单细胞DNA测序联合单细胞RNA测序技术证明了TNBC患者体内的耐药基因在治疗之前就已经存在，NAC过程中的化疗药物对患者体内的耐药基因进行了适应性筛选，使耐药基因重编程得以转录表达，从而导致化疗无效。文章对于未来三阴性乳腺癌患者的临床治疗有很大的指导意义。首先，在接受化疗之前，检测三阴乳腺癌患者的肿瘤克隆，也许有助于预测哪些患者有望从化疗中受益。其次，将患者分为敏感型和耐药性，可能对患者的预后或生存有意义。此外，根据文章建立的肿瘤耐药进化模型可以开发出更有针对性的治疗策略：其一，文章揭示的进化模型阐明了癌症为何难以根治，因为一个肿瘤内部的细胞种类很多，并且都在不停的进化，产生了各种突变，正所谓“狡兔三窟”，所以靶向分支突变的治疗效率很低。但是如果将目光转向寻找肿瘤进化过程中的主干突变，效率可能会有极大的提高[3]。其二，对癌细胞赶尽杀绝可能更容易激发肿瘤内部早已存在的耐药基因，使其表达从而产生耐药性，所以采用缓和的疗法，抑制或者稳定癌症，或许比直接杀死癌细胞更能避免耐药性的产生，这也就是中医上讲的“带瘤生存”，调节平衡，补正抑邪[4]。

参考文献

1.Davis,A.;Gao,R.;Navin,N.Tumorevolution:Linear,branching,neutralorpunctuated?BiochimBiophysActaRevCancer,,-,doi:10./j.bbcan..01..

2.Gao,R.;Kim,C.;Sei,E.;Foukakis,T.;Crosetto,N.;Chan,L.K.;Srinivasan,M.;Zhang,H.;Meric-Bernstam,F.;Navin,N.Nanogridsingle-nucleusRNAsequencingrevealsphenotypicdiversityinbreastcancer.Nature

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