骨科专题九安可晶作为化疗药物载体治疗骨
生物蛋白胶作为化疗药物载体治疗骨肉瘤的意义
白 波 韩大庆 吴景明 徐 谦
(广医院骨科,广东广州)
摘要 目的:探讨生物可降解纤维蛋白胶体作为恶性骨肿瘤化疗药物载体的可能性。方法:对骨肉瘤细胞株进行培养,采用MTT法测定化疗药物及不同浓度纤维蛋白对骨肉瘤细胞的抑制率,相对敏感药物梯度浓度的肿瘤抑制率,敏感药物与纤维蛋白联合应用对肿瘤的抑制率。结果:①单纯低、中浓度纤维蛋白对骨肉瘤细胞在体外有轻度抑制作用,高浓度则有促进瘤细胞生长作用。②低、中浓度纤维蛋白与盐酸阿霉素联合应用的抑瘤率比单纯盐酸阿霉素的抑瘤率低,但无统计学差异(P0.05),高浓度纤维蛋白则有促进瘤细胞生长作用。纤维蛋白与顺氯伯(CDDP)联合应用的抑瘤率随纤维蛋白浓度升高而增高,各组间差异显著(P0.05)。纤维蛋白与甲氨蝶呤(MTX)联合应用在高浓度组抑瘤率明显增高(P0.05)。结论:纤维蛋白胶可作为CDDP、MTX而不是阿霉素(ADM)的良好缓释载体,并可增强前两者的药效。纤维蛋白胶与敏感药物制成的缓释系统用于局部治疗可在降低术后复发率上起到积极的作用。
骨肉瘤是常见的骨原发性恶性肿瘤,青少年多见,病死率极高。传统治疗(截肢、化疗、放疗)效果不佳。由于目前化疗的用药量比以前大得多,因此越来越注意到药物的中毒问题。将化疗药物与载体结合组成的缓释系统能有效提高局部肿瘤组织化疗药物的浓度和作用时间,最大限度地减少化疗的全身副作用,减少用药次数,提高疗效,也因此成为目前研究的热点。纤维蛋白胶是一种组织相容性很好的生物材料,可与大多数化疗药物结合,具有可自行降解、不影响化疗药物活性和制作简单的优点。我们将它作为一种载体与化疗药物结合,对其体外抑瘤效果进行研究,取得了满意的结果。
1 材料与方法
1.1 材料
骨肉瘤细胞OS-(医院建株,取自中山大学病理室)。
1.2 试剂
纤维蛋白溶液。MTX:上海华联制药有限公司,批号,。CDDP:齐鲁制药厂,批号,。ADM:浙江海正药业股份有限公司,批号,.MTT试剂盒,CHEMICON公司产品,晶美公司提供。
1.3 实验方法
1.3.1 骨肉瘤细胞株传代培养 骨肉瘤细胞株培养于PRMI培养液※加入10%小牛清(10万μ/L),链霉素(mg/L)※单层培养于37℃含5%恒温箱※将长成致密单层的细胞※吸除培养液※加入消化液(0.25%胰蛋白酶)5～8滴,轻摇培养瓶,置室温下2～3min※冲洗※加营养液吹打直到全部细胞被冲下,轻轻混匀制成细胞悬液※计数※吸取1mL细胞悬液移入另一培养瓶中,原培养液中留下1mL细胞液,并向每瓶中加入新培养液4mL,盖好瓶塞,轻轻摇匀后置37℃恒温箱中培养。
1.3.2 不同浓度纤维蛋白对瘤细胞的作用 取对数生长期的细胞,调整细胞浓度为(1.5～2.5)×个/mL瘤细胞液接种于96孔微量平底培养板中,分别加入0.1%、1%、10%纤维蛋白液20μL/孔,各5孔,对照孔加入0.01mmol/L,pH7.2的PBS20μL/mL。37℃,5%湿化CO2中孵育72h,快速翻板甩去培养液,加入5mg/mL的MTT液10μL/孔。37℃,5%湿化CO2中孵育4h,加入0.04mol/L的酸化异丙醇μL/孔,室温下震荡10min,用酶联检测仪测D值(λ=mm)。计算抑制率:=(1-测试组D值/对照组D值)×%。根据沈靖南等[2]标准,当抑制率50%为重度抑制,在30%～50%为中度抑制,在10%～29%为轻度抑制,10%为不抑制。
1.3.3 不同药物浓度对瘤细胞的作用 用0.01mol/L,pH7.2的PBS把阿霉素(ADM)配成:0.04μg/mL、0.4μg/mL、4μg/mL,顺胺氯伯(CDD2P)配成.:0.2μg/mL、2μg/mL、0μg/mL,甲氨蝶呤(MTX)配成:0.03μg/mL、0.3μg/mL、3μg/mL。各取20μL/孔分别加入接种骨肉瘤细胞悬液(μL/孔)的96孔微量培养孔中,每一浓度设5孔,对照孔加入0.01mol/L,pH7.2的PBS20μL/孔。同法测得D值及计算抑制率。
1.3.4 不同浓度纤维蛋白与药物联合对瘤细胞的培养作用 用0.01mol/LpH7.2的PBS把ADM、CDDP、MTX分别配成其血浆峰值浓度(0.4μg/mL、2μg/mL、0.3μg/mL),各取20μL/孔分别加入接种骨肉瘤细胞悬液(μL/孔)的96孔微量培养孔中,各药物设20个孔,再加入0.1%、1%、10%蛋白液20μL/孔,各5孔,对照孔设5个,加入0.01mol/L,pH7.2的PBS20μL/孔。同法测D值及计算抑制率。
1.4 统计学方法
采用SPSS10.0软件分析,用单因素方差分析及LSD-t检验法行组间多重比较,P0.05为差异有显著性。
2 结 果
2.1 不同浓度纤维蛋白对瘤细胞的作用低浓度纤维蛋白(0.1%)对骨肉瘤细胞的抑制率为(14.1±2.6)%;中浓度纤维蛋白(1%)对骨肉瘤细胞抑率为(18.2±3.2)%;高浓度纤维蛋白
(10%)则促进细胞生长(有胶状沉淀)。
2.2 相对敏感药物的梯度浓度对骨肉瘤细胞的抑制率
0.04、0.4、4mg/L的ADM对骨肉瘤细胞的抑制率分别为0、(56.9±3.2)%、(75.9±5.6)%(P0.05);0.2、2、20mg/L的CDDP分别为0、(16±2.8)%、(84.8±7.9)%(P0.05);0.03、0.3、3mg/L的MTX分别为(23%±3.1)%、(27.7±3.2)%、(37%±2.4)%(P0.05)。结果表明抑瘤药物的浓度与抑瘤率呈正相关。
2.3 不同浓度纤维蛋白与抗癌药物联合应用对骨肉瘤细胞的抑制率(见表1)。
1 不同浓度纤维蛋白与抗癌药物联合应用对骨肉瘤细胞的抑制率
结果表明:纤维蛋白胶蛋白浓度越高,ADM对骨肉瘤细胞的抑制率越低,高浓度则促进瘤细胞生长(并且可见沉淀)。而在CDDP和MTX组,高浓度可促进抗癌药物的抑瘤率,且两者呈正相关。
3 讨 论
骨肉瘤是一种高度恶性肿瘤,术后复发率较高。化疗是联合治疗的主要方法之一。本实验用ADM、CDDP及MTX的血浆峰浓度(浓度分别为0.4μg/mL、2μg/mL、0.3μg/mL)进行骨肉瘤体外药敏试验,使用MTT分析法所测得的抑制率分别为:56.9%、16.9%、27%。根据沈靖南等标准,顺氨氯铂、甲氨蝶呤血浆峰值浓度对骨肉瘤细胞轻度抑制作用,常规剂量的阿霉素血浆峰值浓度对骨肉瘤细胞有高度抑制作用。虽然骨肉瘤细胞对上述化疗药物敏感,但峰值浓度(即中毒极限浓度)仅对骨肉瘤细胞有轻度抑制作用(尽管阿霉素血浆峰值浓度抑制率可归属重度抑制范围,但也只有56.9%),因此常规静脉给药无法达到要求。而骨肿瘤术后理想的局部用药应选择局部用量大,维持时间长,全身血药浓度低及副作用小的缓释制剂。一般的局部用药物显然无法达到要求;而可能采取的措施是在局部应用敏感化疗药物的缓释制剂。
纤维蛋白胶是一种立体网状的凝胶材料,是由纤维蛋白溶液在凝血酶的作用下,水解成纤维蛋白单体,相互交联而形成网状结构。在药物含量相同情况下,纤维蛋白浓度越高,网孔越致密,从而药物释放量应越低。而另一方面浓度越高的纤维蛋白在成胶过程中纤维蛋白原水解,消耗水增多,使其在成胶后含水量相应降低,所含药物浓度增高,反而可提高药物的释放速度。
在本实验不同浓度纤维蛋白对瘤细胞的抑制作用表明:低浓度(0.1%)和中浓度(1%)纤维蛋白对肿瘤细胞有轻度抑制作用,而高浓度(10%)纤维蛋白则出现促进瘤细胞生长作用,并有胶状沉淀。不同浓度的纤维蛋白胶与峰值浓度ADM联合应用的结果表明:纤维蛋白胶可降低ADM的抑制作用,且其与蛋白浓度呈正相关,高浓度则促进瘤细胞生长(并且可见沉淀)。可能原因是盐酸阿霉素呈强酸性,与纤维蛋白联合应用,可使纤维蛋白变性,并且发生沉淀,降低了阿霉素的药效。不同浓度的生物蛋白胶与峰值浓度CDDP、MTX联合应用。可促进CDDP、MTX的抑瘤作用,并且与纤维蛋白浓度呈正相关。StendelR[4]等研究表明,抗肿瘤药牛磺罗定和纤维蛋白胶结合后,药物的化疗效果不但没有减低,反而有效浓度能维持2周。SimpsonAE[5]等研究表明,卡铂与纤维蛋白胶结合后,其释放特性比单独应用卡铂更易控制,用药量显著减低。因此,纤维蛋白胶可作为骨肉瘤细胞敏感药物CDDP、MTX等缓释系统的良好释放载体,该缓释载体的局部应用可能对降低骨肉瘤术后复发起积极作用。
参考文献：略
文献出处：广州医学院学报第.33.5
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